纳米纤维与细胞相互作用的生物表界面调控

王毅,清华大学摩擦学国家重点实验室

摘要 细胞是人体生命活动的基本单位,任何生命活动包括组织的再生和疾病的爆发等都与细胞的行为密不可分。研究生物医用材料与细胞的表界面相互作用一直是非常热门而且重要的课题,因为这不仅涉及到用于人体的生物材料的安全性问题,而且对于组织工程、再生医学和疾病治疗的研究有极其重要的意义。近些年来,随着纳米科技的快速发展,由静电纺丝技术制备的聚合物纳米纤维成为了一种较新颖和热门的生物材料,纳米纤维的三维纳米网络结构很好模拟了细胞外基质的组成结构,因此越来越多的研究人员将精力投入在研究纳米纤维与细胞表界面相互作用的现象和机理上,以期望能利用纳米纤维的特殊结构来调控细胞行为,从而实现医学难题的重大突破。基于此,本调研报告将着重介绍静电纺丝与纳米纤维、细胞生物学基础理论以及纳米纤维与细胞相互作用的最新进展。

关键词:生物材料;静电纺丝;纳米纤维;细胞行为;表界面作用

传统的摩擦学是研究材料表面摩擦行为的学科,即研究相对运动或有相对运动趋势的相互作用表面间的摩擦、润滑和磨损的基础理论和技术[1]。随着摩擦学的深入发展,摩擦学学科已经发展为跨学科、多学科的科学技术,如纳米摩擦学[2, 3]、生物摩擦学[4]及生物材料的纳米摩擦学[5]等,但摩擦学本质上依然是研究构成摩擦副的至少两个材料或物质或生命体之间的表界面相互作用的学科领域范畴。

细胞是构成生命体的最基本、最重要的组成单位,细胞的行为如粘附、铺展、增殖、迁移、分化等都与生命生长过程和疾病的发病机理密切相关。细胞与生物材料的生物表界面相互作用一直是备受关注的课题,其重要性不言而喻,如果能够研究透细胞材料表界面的相互作用,那么人为控制细胞的各种行为就变得可行,这样对组织的再生、疾病的治疗都有着极其重要的意义。聚合物纳米纤维是研究的比较热门的生物材料之一,纳米纤维不仅可以从结构上模拟细胞基质,而且其比表面积大而适合载药,已经在组织工程[6]、再生医学[7]和药物控释[8, 9]等领域得到了广泛应用。

研究纳米纤维与细胞相互作用是很有必要的。细胞在细胞外基质上的粘附调节着细胞的诸多其他功能如铺展、增殖和分化等,因而在胚胎发育、成熟组织机体内平衡和疾病的发病机理等方面起着至关重要的作用[10-12]。但是由于细胞外基质的生理和生化功能太难以实验方法模拟,人工合成的材料已经在细胞行为调控方面显得至关重要,比如水凝胶材料的力学性能、结构和化学成分都能精细控制,在这样光滑和扁平的表面上的细胞行为已经被大量广泛研究[13-15]。不过在体内,细胞外基质是一个三维的复杂微纳米纤维结构,显然水凝胶材料是很难模拟的[16-18]。聚合物纳米纤维结构恰恰非常好的模拟了人体细胞外基质的结构,而且静电纺丝方法制备的纳米纤维可以非常好的调控纤维的结构和性能,因此如果研究好了各种不同结构和性能的纳米纤维与细胞的表界面相互作用的机理,那么不仅细胞外基质如何与细胞相互作用的机理也可以被揭示(有助于更深入了解和认识生命过程),而且人为控制细胞的行为也变得可能(有助于更好地控制和改造生命过程)。

提到材料与细胞的表界面作用,首先不得不提细胞自身的表面结构和其行为。这部分将先简单介绍细胞表面构成以及细胞的增殖、粘附(黏着)、分化和迁移(运动)等行为的相关基础知识,然后再基于近些年已经发表的文献介绍纳米纤维与细胞的表界面作用的最新进展。

细胞是生命活动的基本单位,对于生命的重要性不言而喻,可以毫不夸张地说,细胞就等于生命[19]。构成生命体的细胞种类繁多,形态结构与功能各异,但是却又有共同的基本点如相似的化学组成、磷脂—蛋白双分子层组成的生物膜、相同的遗传装置和一分为二的分裂方式。

在细胞表面,存在着蛋白、糖蛋白、蛋白多糖和糖脂等,它们镶嵌在脂质双分子层间形成流动的结构。构成细胞膜的两亲性脂类分子会自发组成双分子层,其亲水部分与膜蛋白的亲水氨基酸侧基结合,而膜脂的疏水部分与膜蛋白的疏水氨基酸侧基结合,这样,通过分子间有序的亲水键、疏水键协同作用,形成了稳定的细胞膜结构。细胞膜表面的糖蛋白和蛋白多糖直接参与细胞的特异性识别和粘附作用,目前已经发现的主要细胞粘附分子是跨膜的糖蛋白,这些分子分为整合素、钙连素、选择素和免疫球蛋白家族几类。其中整合素介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的识别作用,与细胞在聚合物表面的粘附、生长、分化过程密切相关[20]。其他的糖蛋白和蛋白多糖同样也可以发挥细胞粘附受体的作用,但是特异性比整合素要低得多。最先发现的整合素粘连位点是RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)三肽[21],该多肽序列和整合素的特异性几乎和粘附蛋白的作用一模一样。此外,还有YIGSR五肽序列、IKVAV五肽序列等也具有类似作用[22]

细胞常见的主要行为有增殖、粘附、分化和迁移。

细胞增殖(proliferation)是细胞生命活动的重要特征之一,最直观的表现是细胞分裂,即由原来的一个亲代细胞变为两个子代细胞,使细胞的数量增加[23, 24]。细胞在分裂之前还必须进行一定的物质准备,要不然细胞不能分裂,物质准备和细胞分裂是一个高度受控的相互连续地过程,这一过程即为细胞增殖。细胞增殖是通过细胞周期来实现的,这是高度严格受控的细胞生命活动的全过程,任何细胞在其增殖过程中都必须遵循一定的规律。例如,DNA在没有完全复制之前,细胞不能分裂;DNA在复制准备阶段尚未完成之前,DNA不能起始复制。在细胞增殖的过程中,任何一个关键步骤的错误,都有可能引起严重的后果,或者引起细胞癌变,或者导致细胞死亡。

细胞的粘附(adhesion)是细胞的社会联系的一种,在多细胞生物体内,没有哪个细胞的孤立的,它们一定通过细胞的通讯、黏着、连接以及细胞与细胞外基质的相互作用构成复杂的细胞社会[25, 26]。细胞表面识别与黏着的分子基础是细胞表面的细胞黏着分子。细胞黏着分子都是整合膜蛋白,介导细胞与细胞间的黏着或细胞与细胞外基质间的黏着,这些分子通过3种方式介导细胞识别与黏着:1,同亲型结合,相邻细胞表面的同种黏着分子间的识别与黏着;2,异亲型结合,相邻细胞表面的不同黏着分子间的相互识别与黏着;3,衔接分子依赖性结合,相邻细胞表面的同种黏着分子借助其他衔接分子的相互识别与黏着。这些分子多数需要依赖Ca+Mg2+才能起作用。

细胞分化(differentiation)是多细胞有机体发育的基础,也是目前干细胞研究中面临的核心问题,也与组织再生和胚胎发育密切相关[27, 28]。现代科学已证明,细胞分化是细胞选择性地表达各自特有的专一性蛋白质而导致细胞形态、结构与功能的差异。不同类型的细胞各自表达一套特异的基因,其产物不仅决定细胞的形态结构,而且执行特定的生理功能。基因的选择性表达主要是由调节蛋白所启动,调节蛋白的组合是影响细胞分化的主要的直接因素。一般来说,这种影响主要受胞外信号系统的调控,而胞外信号及细胞微环境又是通过细胞的信号转导调控网络来起作用,因此对细胞分化有影响的因素主要有受精卵细胞质的不均一性、胞外信号分子、细胞间的相互作用与位置效应、细胞记忆与决定、外部环境如温度等、染色质变化与基因重排。

细胞迁移(migration)是生命体常见且重要的现象[29, 30],比如神经系统发育过程中,神经嵴细胞从神经管向外迁移;在发生炎症反应时,中性粒细胞从血液向炎症组织迁移。这些细胞运动主要是通过肌动蛋白的聚合及与其他细胞结构组分的相互作用来实现的。以成纤维细胞为例,细胞迁移过程通常包含以下几个相继发生的事件:首先,细胞表面在它运动方向的前端伸出突起;然后,细胞伸出的突起与基质之间形成黏着斑,使突起附着在基质表面;第三,细胞以附着点为支点向前移动;最后,位于细胞后部的附着点与基质脱离,细胞的尾部前移。在该过程中,均涉及肌动蛋白以多种方式发挥作用。

纳米纤维与细胞表界面相互作用的相关文献近些年持续增长。Zeeshan Khatri[31]研究了细胞在聚己内酯(PCL-聚乳酸(PLA)复合纳米纤维界面上的粘附行为。他们首先利用传统的溶液静电纺丝方法制备了五组成分质量比例不同的纤维,分别是PCLPCLPLA2:1)、PCLPLA1:1)、PCLPLA1:2)、PLA,随后利用扫描电子显微镜(SEM)观察了细胞在5组纤维上的粘附状况,结果表明随着纤维中PLA比例的增加,细胞的粘附越强。

电信号是细胞与外界通讯的重要信号,有研究表明当纤维的导电性增强时,与纤维界面作用的细胞功能化会增强。Shao Shijun[32]将多壁碳纳米管MWCNTs以不同比例载入了无规和定向PLA电纺纤维中,根据纤维的取向不同和MWCNTsPLA质量分数的不同将制备的纤维依次命名为R1(无规,1%)、A1(定向,1%)、R3A3R5A5。通过电阻率的测定,他们发现当纤维中MWCNTs的含量在3%以上时,导电性开始趋于稳定,不再显著增强。随后他们将成纤维细胞以同样的数量接种在纤维表面,并用50 μA100 μA200 μA的直流电对细胞进行刺激,然后将纤维染色(图2)在激光共聚焦显微镜下观察其行为。结果表明,直流电的作用会对细胞增殖有促进作用,相对于50 μA组,100 μA200 μA组的促进作用更强,而且在同样的电流大小下,定向纤维比无规纤维上细胞要生长的好。有趣的现象是,即使没有电流的参与(0 μA组),随着MWCNTs含量的增加,细胞数量也随之增加,说明导电的MWCNTs加入有可能促进了细胞生长周期中的通路。同样的,在另一篇报道中,提高纳米纤维的导电性可以促进心肌细胞的伸长和同步跳动[33]

图2 不同大小的电流对导电复合纳米纤维-细胞的作用[32]

不同的纳米纤维的表面形貌会对细胞的行为起调控的作用[34, 35]Luo Chao[34]通过配置不同浓度的PLA溶液来静电纺丝,制备了不同表面粗糙度的纤维。纤维表面的珠状突起往往被认为是纤维制备的缺陷,但他们研究表明,纤维的串珠结构不仅不会对细胞有任何毒性,反而可以因此调控细胞的行为诸如粘附和分化等。经过体外细胞实验和体内皮下成骨实验的验证,结果发现设计合适表面粗糙度的微纳米纤维可以大大促进干细胞的粘附以及向成骨方向的分化。也有一些研究者利用纳米纤维的表面微图案[36]来控制细胞的行为。如图3所示,利用一些特殊的静电纺丝接收装置可以得到表面具有可控微图案的纳米纤维(图3a),有些地方纤维比较密集,有些地方相对稍微稀疏,构成了不同尺寸的微图案。当细胞接种至这样图案的纤维上后,培养五天后染色并在激光共聚焦下观察(图3b),结果非常直观的表明,细胞几乎全部只出现在纤维密集的地方,这是个非常有趣的现象,基于此我们可以调控细胞在纤维上特定位置的粘附和生长,从而为多细胞体系的空间有序构建提供了可能。

a

b

3 a)可控制的纳米纤维微图案;(b)细胞接种在这些微图案5天后的激光共聚焦图片[36]

除了纤维的物理图案,生化图案也能以类似的结果来调控细胞的特定位置粘附。如图4所示,Jason课题组[37]利用纤维表面与RGD的紫外光反应,用光掩膜板可控的得到了RGD分子图案化的纳米纤维,其界面上的细胞便会选择性地粘附在这样的生化图案上。

4 A)光掩膜板;(B-D)纤维界面上细胞染色图片[37]

石墨烯是近些年非常热门的一种二维纳米材料,尽管其用在生物医学中的安全性有一定争议,有一些研究组还是探索性地把石墨烯与聚合物纳米纤维复合然后研究其与细胞的表界面作用情况[38, 39]。例如,Ki-Bum Lee课题组[38]的研究表明,表面附载有石墨烯的电纺纳米纤维会促进干细胞向寡树突胶质细胞分化。

对纤维表面进行物理改性或者化学接枝也可以调控纳米纤维—细胞的生物表界面反应[40-42]Liu Wei[42]对静电纺PLA纳米纤维利用O2等离子体表面改性的方法获得了表面带有活性基团羟基等的亲水表面,纤维—细胞的SEM图结果表明,改性后的PLA纤维更有利于纤维的粘附。也有课题组研究发现聚合物纳米纤维表面接枝儿茶酚等分子后可以大大促进细胞的粘附[40],因为儿茶酚分子的表面基团促进了细胞粘附界面反应的识别从而增强了粘附过程。

另外,值得一提的是,纳米纤维纳米尺度的力学如刚度等也有可能影响细胞的行为。在2015年,Nature Materials上发表了关于纳米纤维刚度对细胞粘附、铺展和迁移行为的影响的深入研究工作[43]。如图5所示,该文献首先制备了不同刚度或者说软硬不同的纳米纤维、水凝胶和胶原蛋白基质,然后考察了细胞在其界面上的粘附行为。结果表明,对于水凝胶来说,细胞在更硬样品上铺展面积更大,粘附更好;而对于纳米纤维来说,结论刚好相反,更软的样品上细胞粘附和铺展更好。如前面背景知识所介绍,细胞只有更好的粘附才有可能更好的迁移。图6给出了细胞在以上材料界面迁移运动的结果,结果确实与粘附情况一致,对于纳米纤维来说,较小的刚度更适合细胞的迁移,细胞迁移速度越快,越软的纤维越适合细胞重置其周围的环境,如拉动纤维前进。

5 细胞在三组不同软硬材料上的粘附情况和铺展面积[43]

6 细胞黏着斑在3h内运动的激光共聚焦叠加图[43]

生物材料与细胞的表界面相互作用研究是生物材料的研究和评价中极其重要的内容,其重要性不仅在于生物材料的评价必须通过研究对应的细胞对材料是如何反应来实现,而且细胞行为的调控也必须基于材料与细胞的界面反应来达成,前者的实现有助于我们筛选和设计具有生物相容性的多功能生物材料,后者的达成有利于控制组织的再生和疾病的治疗等生命过程。

作为生物材料的一种,由静电纺丝方法制备的聚合物纳米纤维备受广泛关注和研究,其中纳米纤维与细胞的表界面相互作用的研究显得尤为重要,如上所讨论,已经有大量的文献在持续报道这一块的内容。但是由于细胞的种类不同,其自身表界面的性质除了共性外又存在着一些个性,而且像癌细胞这样的细胞其表界面性质一直处于动态变化之中,所以研究清楚纳米纤维与细胞的表界面作用的机理显得尤为困难。值得令人庆幸的是,目前已经有越来越多的研究人员进入这个领域的探究,相信以后通过结构和性能可控的工程化纳米纤维来更加深入的探索其与细胞作用的表界面作用的机理将成为热门。

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