生物医用静电纺温敏纳米纤维

穆齐锋1,高鲁2,沈红豆 2, 邓伶利 2, 储智勇 2, 张青松 1*

(1 天津工业大学材料科学与工程学院 2 天津工业大学纺织学院, 天津, 300387

E-mail: zqs8011@163.com)

要:近年来,随着纳米技术和组织工程技术的发展,刺激响应性纳米纤维材料在药物控释、伤口敷料和生物支架等生物医学方面的应用受到广泛关注和研究。本文针对温度敏感性纳米纤维,详细综述了基于静电纺丝技术的生物医用温敏纳米纤维原材料、制备途径和表征方法,探讨了温敏纳米纤维在药物控释载体和细胞支架领域的具体应用,并基于相关研究提出了其在发展过程中存在的问题并对其应用前景进行了展望。

关键词:静电纺丝,温敏,纳米纤维,药物控释,细胞支架

研究组和负责人简介

张青松(1980),男,山东菏泽人,工学博士,天津工业大学材料学院副教授,硕士生导师,博士生指导教师资格,中国化学会、美国化学会和中国材料研究学会会员,天津市高校优秀青年教师,教育部学位中心论文评议专家,天津市政府采购评审专家,功能与智能高分子材料创新团队成员,材料科学基础教学团队成员,清华大学化学系和匹兹堡大学化学系访问学者。

课题组名为“青青园中葵”,取自《长歌行》,课题组目前共有教师3人,研究生6人,本科生18名,主要从事有机/无机纳米复合材料、光子晶体凝胶传感器、CO2和染料吸附凝胶、细胞片层凝胶载体、微生物发酵多孔凝胶、多功能纳米凝胶纤维等相关研究。主持完成天津市高等学校科技发展基金计划、天津市高校优秀青年人才项目、教育部科学技术研究项目、天津市自然科学基金、天津市科技特派员、国家自然科学基金等各类项目16项;已在 J Control Release、Macromol Rapid Comm、J Colloid Interf Sci、Colloids Surf B、J Biomed Mater Res A 和 Mater. Sci. Eng.C 等期刊发表学术论文 69 篇,总引用440次,单篇最高引用56次;是Adv Mater、 Adv Funct Mater、ACS Appl Mater & Inter、Macromol Rapid Comm、Phys Chem Chem Phys等28种期刊的审稿人。申请国家发明专利23项,授权18项,成功转化2项。已培养研究生9人,本科生32名,指导学生先后获得第十三届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛二等奖、天津市第十二届挑战杯一等奖、天津市优秀硕士论文、天津市优秀本科学位论文、第七届全国大学生创新创业年会推介项目。

多年来,由于疾病、人口老龄化、意外事故等造成大量的人体器官和组织的损坏和功能缺失,如何实现人体组织和器官的快速修复和重建以及治疗药物在人体内的可控释放已成为生物医学研究领域面临的重要问题[1]。使缺损的组织和器官得以修复和重建,其过程是构建有生物活性的细胞支架材料,这种支架可以载有生长因子或本体细胞,植入体内后支架材料逐渐被分解和吸收的同时,细胞增殖并形成新的组织,从而修复缺损组织替代器官,支架材料或作为一种体外装置,暂时替代器官功能,达到提高生命质量,延长生命的目的[2,3]。组织工程支架材料有时还需具备载药的功能,通过药物的靶向释放达到治愈病灶的目的[4]。其中药物载体是药物缓释体系的重要组成部分,也是影响药效主要因素,药物控制释放载体是随着药物学、生物材料学和临床医学的发展而新兴的给药技术。自20世纪60年代以来,对于药物控制释放体系的研究,受到研究者的广泛关注[5] 与传统给药模式相比药物控制释放具有显著的优点,除提高药物治疗的准确性、有效性、安全性外,还明显降低了药物的生产成本和不良反应,药物控制释放材料的研究得到迅速发展,其中制备性能优良的药物载体已成为药物控制释放技术的研究热点。

由于高分子材料的化学组成、加工工艺和性能易于调控,在一定尺度上通过调控聚合过程或加工工艺,可易于改变或调节材料的物化性能,因此把组织工程学和药物控制释放原理与高分子材料结合起来,合成具有生物相容性和刺激响应性的生物功能材料,具有重大的科学意义和广阔的应用前景。静电纺丝作为一种简单、有效、方便而经济的高分子材料加工技术,其技术核心是将具有一定粘度且带有电荷的高分子熔体或溶液在高压静电场中喷射、拉伸细化、劈裂,最终固化成微纳米级纤维状物质的过程[6] 静电纺聚合物纳米纤维具有比表面积大、孔隙率高、良好的三维结构和各向同性的力学性能等优点[7],能够满足组织工程中细胞支架和药物控释载体在比表面积、多孔结构和力学性能等方面的要求,而且具有纤维孔隙结构的支架材料与细胞增殖有良好的适配性,可有效模拟细胞外基质环境,同时比膜状材料更有利于细胞粘附[8]

静电纺温敏纳米纤维多含有温度敏感聚合物,如聚N-异丙基丙烯酰胺(poly(N-isopropylacrylamide), PNIPAm)在其临界溶解温度(lower critical solution temperature, LCST=32oC)时可迅速发生可逆相转变[4],将温敏性这一特点引入到在生物医用材料中广泛应用的静电纺纳米纤维材料,可进一步增加纳米纤维材料的功能,拓展其在生物医学方面的应用,并具有重要的仿生意义。此外,通过设计使静电纺温敏纳米纤维表面功能化或具有多级结构,可用于生物分离[9]、细胞支架[10]、药物控制释放[11]和生物传感器[12]等领域。本文综述了近年来静电纺温敏纳米纤维的制备和设计思路,分析了产物结构、形态和性能的影响规律,指出了表征纤维温敏性的几种方法,重点介绍了其在细胞培养支架和药物控制释放方面的应用研究,并展望其发展前景。

1. 温敏纳米纤维纺丝原料

材料是组织工程支架和药物控释的本体,其选择是决定支架性能和药物载体控释性能的直接因素。作为细胞支架来说,原料应首先具备良好的生物相容性,这决定了细胞在其表面粘附、生长、分化和扩散的难易程度[13]。其次,需考虑原料的基本力学性能和可加工性,因为材料需加工成具有三维空间结构片状或块状才能在上面种植细胞并支持细胞的生长[14]。此外,原料的生物可降解性也是应该考虑的主要因素之一,合适的降解时间可更好地配合细胞生长和组织的发育。作为药物控释的载体,还需要考虑材料和药物的相容性,以及药物的控释性。最后,材料的成本和加工可控性也是制备支架材料时需考虑的因素。

目前,制备温敏纳米纤维细胞支架和药物控制释放载体的原料可分为天然聚合物材料、合成聚合物材料以及复合材料。天然材料包括明胶(gelatin, Gel)、丝胶(silk sericin, SS)、胶原蛋白(collagen, Col)、纤维蛋白(fibrous protein, FP)等,且这些天然材料多以填料的形式和其他温敏性高分子进行复合;合成高分子材料主要是N-异丙基丙烯酰胺(N-isopropylacrylamide, NIPAm)N-乙烯基己内酰胺(N-vinylcaprolactam, NVCL) 羟丁基壳聚糖( hydroxybutyl chitosan, HBCS)、羟丙基纤维素(hydroxypropyl cellulose, HPC)N,N-二甲基丙烯酰胺(N,N-dimethylacrylamide, DMAA)等。天然材料含有利于细胞黏附、迁移和增殖的生物功能基团,但降解速率不易控制、结构复杂和组成多样,且通过杂化、复合、交联等处理的结构稳定性和力学性能的增加有限;而合成材料的分子量和分子量分布易于控制,且能够通过化学合成和后处理工艺控制材料的温敏、力学、光学、热学及生物降解性,但其生物相容性远逊于天然材料。因此,目前生物医用静电纺纳米纤维的原料多是合成材料和天然材料组成的复合材料。表1列举了近些年研究较多的温敏性聚合物单体和其他共聚或共混类功能单体。

2. 化学改性和物理共混法制备温敏纳米纤维

静电纺丝是制备纳米纤维支架材料的普遍方法,可制备出直径在几十到几千纳米的高分子纤维。由于单一高分子纳米纤维的功能比较单一,无法满足生物支架材料在生物相容性、可降解性和多功能性等方面的要求,因而通过接枝或共聚等化学方法改性以及物理共混法制备复合性温敏纳米纤维成为目前研究的热点[16-29]

2.1化学改性法

Oh[16]N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂,配制浓度为3wt%的聚苯乙烯(PS)纺丝液,通过静电纺丝制备PS纳米纤维垫,然后在PS纳米纤维上接枝PNIPAm分子链,制得温敏纳米纤维支架。图1为接枝和未接枝的PS纤维和培养板表面的原子力显微镜测试图,接枝处理后纤维表面的粗糙度提高,PNIPAm接枝的PS纳米纤维垫能为细胞提供类细胞外基质的生长环境,人的成纤细胞接种到纤维表面后在37oC下孵化培养,细胞可以在其表面粘附并增殖扩散,置于20oC5 h后细胞变圆并自动从表面脱附(如图2),这种化学改性的纤维支架虽然可以实现细胞在不受损伤的情况下自然脱附,但脱附所需时间太长。欧阳秀等[17]以苯乙烯、马来酸酐和NIPAm为单体,采用可逆加成断裂链转移(RAFT)合成了一系列不同嵌段比的嵌段共聚物聚(苯乙烯/马来酸酐)/PNIPAm (P(St-alt-Man)- b-PNIPAm),并用静电纺丝技术制备了嵌段共聚物纳米纤维,再分别用无水乙二胺对其表面进行交联固定。由实验证明制备的纳米纤维具有一定的温敏性,且电纺纳米纤维交联后的亲水性比未交联的纤维更强。2014年,Chen[18]利用自由基聚合制备P(NIPAm-co-NMA)共聚物,在共聚物中混入对 NO响应的1,2-二氨基蒽醌(DAO),然后通过静电纺丝把共混溶液制备成纳米纤维膜,研究发现纤维膜在25oC-50oC不同温度的水中体积具有明显的变化,同时可通过膜的颜色变化检测水中的NO的浓度,从而为进一步将其作为环境传感器提供了借鉴意义。由于静电纺丝膜具有高的比表面积,因此该电纺膜比刮涂膜有更高的环境敏感性和响应速率。2015年,赵晓梅等[19] NIPAmN-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯(NHS)通过自由基聚合反应合成了poly(NIPAm-co-NHS)共聚物,然后再和Gel以一定比例混合交联生成PNIPAm-Gel,采用高压静电纺丝制备了温敏纳米纤维,并把这种纤维支架材料用于细胞分选和取向细胞片层工程。大鼠成纤维细胞(fibroblast 细胞株) Phoenix 细胞株共培养实验表明通过降温、吹打的方法,Phoenix 细胞首先从支架上脱附,通过这种技术可实现共培养细胞的分离纯化。Rossouw[20]通过溶液自由基聚合(SFRP)的方式分别在聚丙烯(PP)、聚对苯二酸乙二酯(PET)和聚酰胺(PA6)无纺纤维材料表面接枝PNIPAm分子链,构建了具有温敏性的3D细胞支架材料,并用作HC04HepG2肝细胞的增殖培养和热敏感释放,此支架材料可以在无酶促反应和支架降解作用下实现细胞的物理性脱附,从而减少对种子细胞的伤害。柏少卿等[21]NVCLα-甲基丙烯酸单体(MAA)进行自由基共聚反应,合成了具有不同分子量的温敏性Poly(NVCL-co-MAA),分别以疏水的酮洛芬和亲水的卡托普利作为药物模型,通过静电纺丝制备载药纳米纤维,在不同温度下进行体外药物释放实验,在20oC时纤维呈亲水性,药物可被快速释放,在40oC时纤维呈疏水性,药物表现为缓慢释放。石萌等[22]制备了可聚合的药物乙烯酯和含糖乙烯酯共聚单体,以偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂,采用自由基聚合方法制备出含有NVCL的两种共聚物Poly(OVSG-co-NVCL)Poly(OVNG-co-NVCL),再将共聚物和阿魏酸糖酯溶于无水乙醇中,利用静电纺丝成功制备了含有温敏性共聚单体的纳米载药纤维。Okuzaki[23]采用静电纺丝制得NIPAm和丙烯酸十八烷(SA)的共聚物温敏纳米纤维膜,如图3所示,所得纳米纤维直径分布在50-500 nm,干态下的平均直径为207 nm,纤维膜在25oC水中浸泡会发生一定的体积收缩,同时疏水单体SA的引入使PNIPAmLCST32oC降低到23oC左右。此纤维膜具有较好的耐溶剂性和快速的温度响应性,在水下纳米传感器领域具有广阔的应用前景。

2.2物理共混法

Gu[24]采用静电纺丝制备了温敏性的PNIPAm/PLLA 共混纳米纤维膜,该纤维膜具有可控的表面形貌和较好的生物相容性,研究表明PLLA 的引入并没有改变PNIPAm的温敏性,如图4所示,当温度由20oC升到50oC时,PNIPAm/PLLA 纳米纤维表面实现了超亲水向超疏水性转变。Lin[25]DMF溶剂中溶解PNIPAm和聚2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(PAMPS),室温下搅拌3 h配制成均一的纺丝液,采用静电纺丝制得PNIPAm/PAMPS纳米纤维, 通过在PNIPAm/PAMPS 混合纺丝液中添加硝苯地平作为药物模型,能够制得负载药物的PNIPAm/PAMPS 温敏纳米纤维,在pH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中做体外药物释放实验,研究表明通过调节温度可改变药物与PNIPAm/PAMPS之间氢键作用达到药物智能释放的目的。胡娟等[26]以无水乙醇为溶剂,在室温下制备PNIPAm和乙基纤维素(EC)共混纺丝液,通过静电纺丝成功制得温敏性PNIPAm/EC纳米纤维,制备的共混纳米纤维直径为360-400 nm,当纺丝液中的PNIPAmEC的质量比为1:2时,纤维形貌最佳,实验结果证明PNIPAm/EC复合纳米纤维具有良好的温敏性能,可应用于温敏性智能载药材料。Wang[27]PNIPAm、多面低聚倍半硅氧烷(POSS)2-乙基-4-甲基咪唑(EMI)共混并进行静电纺丝,然后把制备的纤维膜置于160oC真空环境下加热4 h,在EMI的催化下POSSPNIPAm发生交联反应,形成交联纳米纤维网络,制备的纳米纤维不仅对温度刺激具有快速的溶胀/去溶胀响应性,还可以在进行50次水合反应/消水合反应循环后仍保持完好的纤维形貌,快速的温度响应性和良好的耐溶剂性使其在纳米制动器和传感器领域具有广阔的应用前景。Shi[28]采用牛血清白蛋白(BSA)-共轭PNIPAm和聚己内酯(PCL)共混物进行静电纺丝,制备的纳米纤维可抵抗血液,促进直接捕捉和隔离的红细胞,温度刺激纳米纤维容易释放捕获的红细胞。在保持细胞的完整性和功能的同时实现捕获并释放红细胞,可更有效地用于分子分析及疾病诊断。Chen[29]利用单针头静电纺丝技术成功制备了PNIPAm()/PCL()核壳温敏纳米纤维,在同样的纺丝工艺条件下,PNIPAmPCL添加的量不同,导致核壳纳米纤维的形貌出现显著差异。不同温度下水接触角实验表明,PNIPAm/PCL纳米纤维在20oC时呈亲水性而在40oC时呈疏水性。温敏纳米纤维膜较弱的力学性能一直是困扰其应用的难题,本课题组通过单针头静电纺丝技术制备了PNIPAm/丝胶/京尼平共混纳米纤维膜,丝胶分子中含有大量的极性基团,如-OH-NH2等,可和生物交联剂京尼平发生交联反应,从而制得具有半互穿网络结构的温敏纤维膜,实验研究发现该膜在80oC(LCST)水浴中具有优异的力学性能,如图5所示,其拉伸伸长率可达原长的28倍,此项研究对进一步开发PNIPAm基纳米纤维膜的应用具有重大意义。

3. 静电纺纳米纤维的温敏性表征

3.1温度诱导下的微观形貌

静电纺丝过程受聚合物溶液性质(聚合物浓度、分子量、纺丝液电导率、表面张力、溶剂性质)、纺丝工艺参数(纺丝温/湿度、电压、接收距离、接收装置)等多种因素的共同影响,因此制备的纤维形貌呈现多样性。扫描电子显微镜(SEM)和原子力显微镜(AFM)是表征纤维微观形貌和结构的重要方法。Chen[29]在相同纺丝工艺条件下,通过调配共混纺丝液中PNIPAmPCL相对于溶液的质量比,获得了形貌不同的温敏纳米纤维。从图6可以看出,随溶液中PNIPAm含量的增加,PNIPAm/PCL纤维之间的黏连现象越少,纤维直径越细。Okuzaki[23]通过静电纺丝技术制备NIPAmSA的共聚物纳米纤维,并利用AFM成功测出纤维在不同温度下的直径,以及随温度升高时纤维体积发生消溶胀的动态图像,如图7,这也是该领域研究中首次拍出单根温敏纤维的体积随温度变化而改变的表观图,这些数据图直观、有力地证明了纤维的温敏性。

3.2温度诱导下的溶胀和消溶胀行为

PNIPAm的温敏性具体体现在不同温度下亲疏水性的变化,含PNIPAm的交联纳米纤维在不同温度下具有不同的溶胀度。Song[30]通过比较聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)纳米纤维与 PMMA/PNIPAm纳米纤维在不同温度下的溶胀度,来分析复合纳米纤维的温敏性。从图8可以看出,PMMA的溶胀度在25oC37oC交替变温下无明显差别,PMMA/PNIPAm纤维的溶胀度对温度具有响应性,且PNIPAm的含量越多,PMMA/PNIPAm纤维在25oC37oC下溶胀度的差异越明显。Kim[31]通过在10oC45oC下循环八次,分别测试NIPAmN-羟甲基丙烯酰胺(HMAAm)共聚物PNH-X (X代表共聚物中HMAAm的摩尔比)电纺纳米纤维的溶胀比率,如图9所示。由于共聚物中含有PNIPAm分子链,交联后的共聚物纳米纤维膜具有低温吸水和高温脱水的响应性。交联后,纳米纤维膜具有一定的耐溶剂性,共聚物中HMAAm的摩尔比为3%时,共聚物纤维溶胀速率最慢,且经三次循环测试就会发生溶解,HMAAm的摩尔比提高,纤维膜的耐溶剂性提高,对溶胀和消溶胀的响应速率也提高。

3.3不同温度下纳米纤维膜的亲疏水性

纳米纤维的水润湿性可以通过水接触角的大小来表征,接触角越小纤维的润湿性越好,含PNIPAm分子链的纳米纤维在不同温度下具有不同的水润湿性。万灵书等[32]采用RAFT可控/“活性聚合方法合成了丙烯腈与NIPAm的嵌段共聚物PAN-b-PNIPAm,再利用静电纺丝技术制备了共聚物的纳米纤维膜,通过测试不同温度下纺丝膜的水接触角,如图10所示,随温度变化,样品PANPAN100-b-PNIPAm72PAN100-b-PNIPAm98的接触角变化幅度没有显著的差异,但随着NIPAm链长的增加其温度响应区间明显变窄,PAN-b-PNIPAm温敏纤维膜的突变温度明显低于PNIPAm的低临界相转变温度。Chen[29]拍摄出20oC40oC时水滴在PNIPAm()/PCL()核壳温敏纳米纤维膜表面的扩展状态,以及20oC40oC下荧光剂染色的木糖葡萄球菌在 PNIPAm/PCL(10%:10%)复合纤维膜上的分布图,如图11所示,证明了PNIPAm/PCL纤维膜表面的亲疏水性随温度变化而变化,呈现低温(20oC)亲水性向高温(40oC)疏水性的转变。

3.4不同温度下对蛋白的吸附和脱附行为

万灵书等[32]合成了嵌段共聚物PAN-b-PNIPAm,再将聚合物溶于DMF配成一定浓度的纺丝液,然后利用静电纺丝技术制备共聚物纳米纤维膜,研究证实该纳米纤维膜具有一定的温度响应性,而疏水性嵌段的引入导致其响应温度较纯PNIPAm有所降低;如图12所示,蛋白质吸附结果表明温度较低时纳米纤维膜表面更亲水,蛋白质吸附较少,所制备的温敏性纳米纤维膜可望用作智能分离与吸附材料。Loh [33]等制备含有聚氨酯(poly(ester urethane))、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)和聚ε-己内酯(PCL)的多嵌段共聚物,再通过静电纺丝获得纳米纤维。图13为多嵌段共聚物纳米纤维和纯PCL纳米纤维在温度分别为25℃和37℃下的胎牛血清蛋白质释放量随时间的变化图,可以看出多嵌段共聚物纳米纤维在不同温度下的释放速率有较大差异,其中37oC下的释放速率高于25oC的,而纯PCL纳米纤维对于胎牛血清蛋白质的释放速率没有温度响应性。

4. 温敏纳米纤维在生物医用领域的应用

4.1药物控制释放

Lin[25]利用单针头静电纺丝技术把温敏性的PNIPAm和聚2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸以及药物模型硝苯地平(NIF)共混纺丝,通过控制温度来调节药物和纤维基体材料之间的氢键作用,以达到药物控制释放的目的。图14NIF在不同温度下的释放量随时间的变化图,随着纤维溶胀时间的延长,药物的释放量会缓慢增加,25oC时由于纤维的部分溶解,药物的释放速率和总量都比其他温度下的测试值大,载药纳米纤维仍然具有温度敏感性,药物释放量可通过改变温度有效控制。Zhang[34]通过静电纺丝技术和紫外光引发在聚乳酸(PLA)纳米纤维表面引发NIPAm聚合,制备具有核壳结构的温敏纳米纤维,体外药物控制释放实验表明:25oCPLA纤维表面的NIPAm表现出亲水性,结合周围水分子的同时,使得50—60%的药物仍包裹在PLA纤维中,当温度升高到40oC时,PLA纤维表面NIPAm疏水作用增强,其分子链变成收缩、卷曲状态,使得溶液携带药物从PLA纤维中释放出去,此时只残留下30%的药物。Hu[35]通过静电纺丝技术把PNIPAm、乙基纤维素(EC)和药物模型酮洛芬(KET)共混纺丝,体外药物释放实验表明:两种共混聚合物具有协同效应,使温敏纤维体系可以保持持续释放药物的特性,25oCPNIPAm呈亲水性同时EC呈疏水性,纤维上负载的药物被快速释放出来,此时药物速率及药物最大释放量比37oC时高,这主要是由于PNIPAm的温敏性造成的。Huang[36]通过氧化还原反应制备了温敏性且可热交联的聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-N-羟甲基丙烯酰胺)(PNN)共聚物,再由静电纺丝制备嵌入载药(盐酸多西环素)壳聚糖基纳米颗粒(CS)的温度和pH双重敏感性的载药纤维膜,图15是不同温度和pH值的水溶液中PNN/CS (95/5)纳米纤维膜对盐酸多西环素控释图,药物释放实验表明:温度为25oC时酸性条件(pH=2)比中性条件(pH=7)更利于药物的释放,pH=750oC25oC更有利于药物释放。Kim[31]通过静电纺NIPAmHMAAm共聚物,再通过热处理使HMAAm分子链上的羟基交联固化的方法制备温敏性纳米纤维,以异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖作为视踪标记药物,八次加热-冷却循环后标记药物完全被释放出来。这种高比表面积、多孔性的纤维膜材料由于其智能性可有望用于药物封装和释放的载体。

14. 不同时间内硝苯地平在PBS溶液中的释放量[25

15. 不同温度和pH值的水溶液中PNN/CS (95/5)纳米纤维膜对盐酸多西环素控释图[36]

4.2生物支架

纳米纤维三维支架能够模拟细胞外基质微环境的物理结构,在其基础上进行表面改性可以进一步模拟微环境的化学信号,为细胞的增殖和扩散提供一个可靠的载体。Rossouw[20]通过溶液自由基聚合(SFRP)的方式分别在聚丙烯(PP)、聚对苯二酸乙二酯(PET)和聚酰胺(PA6)无纺纤维材料表面接枝PNIPAm分子链,构建了具有温敏性的3D细胞支架材料,如图16所示,细胞培养实验发现HC04HepG2肝细胞在支架上沿纤维取向生长,检测出HC04肝细胞在3D支架上代谢出白蛋白的量是在2D支架上的两倍,进而证明了3D支架比2D支架更有利于细胞的生长代谢,同时实现了细胞高温下(37oC)在支架上吸附,低温下(25oC)从支架上脱附。Oh[16]PS纳米纤维垫上接枝温敏性的PNIPAm获得亲疏水性可调的纤维表面,人的成纤细胞接种到纤维表面后在37 oC下孵化培养,细胞可以在其表面粘附并增殖扩散,置于20oC5 h后细胞变圆并自动从表面脱附,接枝改性的PS纳米纤维垫和培养板比未接枝改性的PS纳米纤维垫和培养板有更好的细胞吸附和脱附效果。Kim[37]NIPAm和苯丙酮共轭聚合物共聚,再经静电纺丝制备纤维膜支架材料,紫外光照射后发生交联反应,纤维之间出现搭接形成网络结构,如图17,将人的皮肤成纤细胞在37oC时接种到纤维网表面后,纤维网发生折叠,当降温到4oC时纤维网变成透明的凝胶状,同时细胞被封装、粘附在纤维网内部,再次升温到37oC细胞又被释放出来。该研究通过改变外部的刺激可实现细胞的封装和释放,为实现各种生物活性物的封装和释放提供了新的思路。

16.HC04 (上行)HepG2 (下行)生长在PP-g-PNIPAm-B支架上生长3,7,11,1421(A-E)荧光显微镜图,细胞用荧光双乙酸酯(FDA)着色,用荧光显微镜(Olympus BX41)在放大40倍的倍率下观察,显微镜装配有490 nm的频带过滤器和510 nm的截断过滤器[20]

17. (a-c) 通过光交联BP2纳米纤维网包裹、封装和释放细胞的过程。细胞液滴在37oC下包裹(a)稳定封装在网中,(b)4oC下转变成状,(c)加热到37oC以上快速收缩并释放封装的细胞,(d)4-37oC之间加热和降温细胞从纤维网中释放的百分比,此过程重复三个循环, (e) 从纤维网中释放出来的细胞活性检测图(绿色:活细胞,红色:死细胞,条棒:200 μm), (f) MTT检测3次循环后细胞的增殖活性(白条:在TCPS板上培养的细胞,黑条:在纤维网上培养的细胞)(g) 三次循环以后表示细胞生存能力的荧光图片,经罗丹明染色后的蛋白(蓝色)DAPI(红色),细胞在37oC下培养3 (条棒:100 μm)[37],

5. 结语与展望

人类治疗疾病、改善生活质量的愿望,对生物医用材料的研究提出了更高的要求。随着纳米技术和组织工程技术的发展,已经开发出各种药物控释载体和人工组织器官等,例如硅酸盐、塑料及橡胶材料等,但这些材料首先大多都是非水溶性的,制备过程中难免残留对人体有害的有机溶剂,其生物相容性有待提高;其次这些材料不具备与细胞外基质相似的纳米纤维孔隙结构,不利于药物释放以及细胞的增殖和扩散;再者这些材料的柔软性和摩擦系数等参数与人体软组织之间存在较大差距,使其在实际应用仍存在一些缺陷。

通过静电纺丝技术制备的PNIPAm基的温敏纳米纤维材料具有以下优势:第一:PNIPAm可以溶于水而且具有良好的温度响应性和生物相容性,作为组织工程支架材料可以与细胞保持较好的亲和性,维持细胞的生长和增殖,同时获得温度诱导下的二维细胞片层。第二:具有各向同性的力学性能,作为细胞支架和药物载体时能够保持在体内和体外的三维形态。第三:具有特殊的三维微孔结构,首先可以促进药物或营养物质的扩散以及细胞代谢废物的排出,其次可以为细胞增殖和扩散提供有效空间。因此温敏纳米纤维在药物控释载体和组织工程支架等领域有巨大的开发潜力。然而,温敏纳米纤维材料的特点与活性体的作用机理并不清楚,作为药物载体时其刺激响应的灵敏性还不够理想,在力学、光学等性能的调控上还未形成系统的结论,上述诸多问题仍需国内外研究学者进一步的系统研究。

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